（货号：WLE8202KIT-01）
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【产品名称】
通用名称：DNA恒温快速扩增微球试剂盒（荧光型）-01
【包装规格】
货号：WLE8202KIT-01
规格：96份/盒
【原理概述】
本试剂盒基于一种常温恒温核酸快速扩增技术：在常温恒温下，重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体Rec/ssDNA，在辅助蛋白和单链结合蛋白SSB的帮助下，侵入双链DNA模板；在侵入位点形成D-loop区域，并开始对DNA双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体Rec/ssDNA解体的同时，聚合酶也结合到引物的3’末端，开始链的延伸。本试剂盒在39 ºC下，依赖核酸外切酶的作用，加入根据模板设计的特异的分子探针，使用荧光监测设备能实现对目标片段扩增过程的实时监控。
【产品特点】
本试剂盒具有灵敏度高、特异性强、反应时间短（仅需20 min）等优点，反应组分为微球状态，操作简便，易于保存。
可适用于各种品牌的荧光定量PCR仪，恒温荧光扩增仪器等荧光检测设备。
【引物设计】
建建议使用长度在30-35 bp的引物，引物过短会影响扩增速度和检测灵敏度；引物设计避免形成二级结构而影响扩增；扩增子长度建议在150-300 bp，通常不超过500 bp。
【荧光探针设计】
探针序列不与特异性引物识别位点重叠，长度为46-52 nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。探针共有四个修饰位点：距离5’端的≥ 35 nt的中部位置标记一个dSpacer（四氢呋喃，THF），作为核酸外切酶的识别位点；THF位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个粹灭基团，两个基团的间距为2-4 nt；THF距离3’末端≥15 nt，并且3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或C3-Spacer。
【试剂盒组成】
| 组成 | 含量 |
| buffer微球 | 8 份/管×12管 |
| 正对照模板 | 30 μL×2管 |
| 正对照引物探针Mix | 70 μL×2管 |
| 微球试剂 | 8 份/管×12管 |
| 使用说明书 | 1份 |
【试剂盒储存】
1．储存条件：储存温度 ≤ -20 °C（± 5 °C）恒温环境，避光保存，避免重压、反复冻融；
2．产品有效期：14个月；
3．生产日期见外包装。
【操作步骤】
- 根据待测样本，阴性和阳性对照的数量准备微球试剂，将buffer微球和微球试剂用镊子夹到反应管中，保证每个酶微球试剂配一颗buffer微球；
- 按照每个反应分别加入2 μL上游引物、2 μL下游引物、6 μL探针（引物探针浓度10 μM）、40.4 μL ddH2O和5 μL核酸模板（可根据实际需求调整加入模板的体积，并相应调整加入的ddH2O体积，至模板与ddH2O总体积为45.4 μL）配制反应混合液（注意：核酸模板要配制至反应混合液中，不可先复溶微球后加入模板）；
- 向每个微球反应管中加入50 μL步骤（2）配制的反应混合液，立刻迅速上下颠倒甩动反应管8-10次进行混匀；
- 混匀后，将反应液甩（或快速离心）至管子底部，然后立即将反应管放入荧光检测设备中。荧光检测程序设置为：恒温39 ºC；每30 s采集一次FAM通道（信号采集通道的选择与荧光探针设计一致）荧光值；反应时间20 min。
注：如使用ABI系列PCR仪，请务必于passive reference和quencher处均选择“none”。
体系配制
| 组分 | 体积（μL） |
| 上游引物(10 μM)* | 2 |
| 下游引物(10 μM)* | 2 |
| 探针(10 μM)* | 0.6 |
| ddH2O和DNA模板 | 45.4 |
| 总体积 | 50 |
*正对照反应单元体系配制：正对照模板加入2 μL，加入4.6 μL正对照引物探针Mix（已包含探针和上/下游引物），其他组分参照体系配制。
正对照荧光结果图
图1. P：正对照；N：阴性对照
【注意事项】
1．由于试剂盒灵敏度非常高，在进行反应时请注意避免核酸污染，并设置空白对照；
2．使用时请取出实验所需的MIRA反应单元的数量，剩余部分请置于存储条件下。
