MIRA 技术引物及荧光探针设计原则

技术原理：

MIRA技术是一种多酶恒温核酸快速扩增技术，基本原理是：在常温恒温下，重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体Rec/ssDNA，在辅助蛋白和单链结合蛋白SSB的帮助下，侵入双链DNA模板；在侵入位点形成D-loop区域，并开始对DNA双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体Rec/ssDNA解体的同时，聚合酶也结合到引物的3’末端，开始链的延伸，这个过程迅速高效地循环，从而完成目的片段超快速扩增。

荧光检测则依赖核酸外切酶的作用，加入根据模版设计的特异的分子探针，使用荧光监测设备能实现对目标片段扩增过程的实时监控。

引物设计：

建议使用长度在30-35 bp的引物，引物过短会影响扩增速度和检测灵敏度；引物序列要求：

1.碱基排布随机性高，GC含量在30%-70%之间；

2.避免形成二级结构而影响扩增；

3.扩增子长度建议在150-300 bp，通常不超过500 bp；

PS：特殊情况下设计较长引物比较困难的序列，引物长度可缩短至25 bp，但最好不少于25 bp。

荧光探针设计：

探针序列不与特异性引物识别位点重叠，长度为46-52 nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。探针共有四个修饰位点：

1.距离5’端的30-35 nt的中部位置标记一个dSpacer（四氢呋喃，THF），作为核酸外切酶的识别位点（任何碱基，无特殊要求）；

2.THF位点的上游的T碱基上标记一个荧光基团（如FAM），下游在T碱基上标记一个粹灭基团（如BHQ1），两个基团的间距为2-4 nt；

3.THF距离3’末端≥15 nt，并且3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或C3-spacer。